Komary z wbudowaną „tarczą genetyczną” powstrzymują malarię – wskaźnik zakażeń spada o 93%

Pokonywanie odporności na insektycydy: w jaki sposób pojedyncza modyfikacja genu u komarów rozprzestrzenia się przez kolejne pokolenia, praktycznie eliminując przenoszenie malarii bez negatywnego wpływu na przetrwanie.

W niedawno opublikowanym badaniu w czasopiśmie Nature zespół naukowców zbadał, czy allel glutaminy 224 (Q224) w białku FREP1 (fibrynogen-related protein 1) sprawia, że komary Anopheles stephensi są odporne na zakażenie Plasmodium, oszacował koszty przeżycia związane z tym allelem i przetestował system napędu genowego allelicznego w celu rozprzestrzenienia tej ochronnej mutacji w populacjach.

Wymagania wstępne

W 2023 roku na malarię zmarło około 600 000 osób, głównie dzieci w Afryce Subsaharyjskiej i Azji Południowej. Tradycyjne metody zwalczania – moskitiery, insektycydy, leki przeciwmalaryczne – tracą skuteczność z powodu oporności komarów i pasożytów. Technologie genowe, które rozprzestrzeniają korzystne allele w populacjach komarów, stanowią obiecujące i zrównoważone rozwiązanie.

Białko FREP1 pomaga pasożytom w przechodzeniu przez jelito środkowe komara, ale naturalny wariant Q224 może zapobiegać zakażeniu bez naruszania biologii komara. Celem było sprawdzenie, czy taki endogenny allel może być bezpiecznie rozprowadzany w celu ograniczenia transmisji malarii, jednocześnie zachowując żywotność komara.

O badaniu

Za pomocą CRISPR/Cas9 stworzono dwa szczepy Anopheles stephensi, które różniły się jedynie 224. aminokwasem w białku FREP1: dziki typ z leucyną (L224) i potencjalnie ochronny szczep z glutaminą (Q224). Przewodnik RNA ukierunkował się na region intronu 126 pz przed kodonem, umożliwiając rekombinację homologiczną z wprowadzeniem znacznika fluorescencyjnego (GFP lub RFP).

Kondycję oceniano na podstawie długości skrzydeł, płodności, wylęgowości jaj, przepoczwarzenia, wylęgu osobników dorosłych i długości życia (analiza przeżywalności Kaplana-Meiera).

Kompetencje wektorów określono, stosując standardowe karmienie błonowe pasożytów Plasmodium falciparum (człowiek) i Plasmodium berghei (gryzonie), z liczbą oocyst i sporozoitów w gruczołach ślinowych.

System napędowy alleli zawierał kasetę z gRNA skierowanym przeciwko L224 i Cas9 pod kontrolą promotora vasa. Częstotliwość alleli monitorowano za pomocą znaczników fluorescencyjnych w eksperymentach wielocyklicznych (10 pokoleń). Genotypowanie przeprowadzono metodą PCR, sekwencjonowania Sangera i NGS. Modelowanie bayesowskie pozwoliło oszacować konwersję alleli, koszty dostosowania i dynamikę podczas swobodnego krycia w laboratorium.

Wyniki

Allel FREP1Q224 nie powodował istotnych strat w przeżywalności: długość skrzydeł, płodność, wylęg, przepoczwarzenie i wylęg osobników dorosłych były identyczne jak w grupie kontrolnej FREP1L224. Niewielkie różnice w wielkości i długości życia samców nie miały wpływu na konkurencyjność. Dziewicze samice z allelem FREP1Q224 żyły tak długo, jak w grupie kontrolnej, a samice po karmieniu krwią wykazywały jedynie nieznaczne skrócenie długości życia.

Eksperymenty z wyzwaniami wykazały wyraźną ochronę u homozygot.

• Przy niskich stężeniach gametocytów P. falciparum (0,08%):
  • Wskaźnik zakażeń spadł z 80% do ~30% w FREP1Q224;
  • Średnia liczba oocyst: od 3 do 0;
  • Sporozoity w gruczołach ślinowych: od >4000 do 0.
• Przy wyższej gametocytemii (0,15%):
  • Średnia liczba oocyst: od ~32 do
  • Liczba sporozoitów również drastycznie spadła.
• Dla P. berghei:
  • Średnia liczba oocyst: od 43 do 25;
  • Sporozoity: od ~19 000 do 11 000.
• Heterozygoty (FREP1L224/Q224) nie były chronione.

Wydajność napędu genetycznego

• W krzyżówkach parowanych Cas9 + gRNA L224 przekształciło 50–86% alleli FREP1L224 w FREP1Q224;
• W przypadku Cas9 matki częstotliwość była wyższa;
• W drugim pokoleniu częstość allelu ochronnego osiągnęła 93%;
• Częstość występowania błędów w szlaku naprawy NHEJ była niska (0–12%) i zwykle powodowała uszkodzenia.
• W populacjach komórek ze stosunkiem dawcy do biorcy wynoszącym 1:3 częstość występowania genu FREP1Q224 wzrosła z 25% do >90% w ciągu 10 pokoleń;
• Częstotliwość występowania alleli NHEJ spadła z 5,4% do

Modelowanie bayesowskie potwierdziło hipotezę wysokiej konwersji, niskiej częstości stabilnych mutacji i efektu letalnego sterylnego mozaicyzmu, w którym homozygoty WT z genotypem Cas9 matki cierpiały na mutacje somatyczne i miały zmniejszone przeżycie.

W późniejszych pokoleniach zaobserwowano niemal całkowite zahamowanie liczebności oocyst P. falciparum (mediana od 0 do 5,5), co potwierdza, że populacja stała się w znacznym stopniu odporna na przenoszenie pasożytów.

Allel ochronny nie miał żadnych ukrytych korzyści ani skutków ubocznych i rozprzestrzeniał się drogą pokarmową.

Wnioski

Badanie wykazało, że zastąpienie pojedynczego aminokwasu w białku FREP1 i zmiana jego dziedziczenia za pomocą napędu genetycznego może sprawić, że Anopheles stephensi stanie się praktycznie odporny na malarię – zarówno u ludzi, jak i u gryzoni – bez narażania na ryzyko przetrwania komarów.

To podejście uzupełnia istniejące środki (siatki, insektycydy, leki), których skuteczność zmniejsza się z powodu oporności. System ten może być również stosowany do przywracania wrażliwości na insektycydy lub wprowadzania innych alleli ochronnych.

Zanim będzie można wdrożyć tę technologię, konieczne jest wprowadzenie rygorystycznych ram dotyczących ochrony środowiska, etyki i zarządzania, a także systemów kontroli rozpowszechniania.