Jedna fiolka, dwa cele: przenośna diagnostyka gruźlicy oparta na CRISPR o 100% czułości

Artykuł na temat przenośnego testu na gruźlicę, który można wykonać bezpośrednio z plwociny, bez skomplikowanego sprzętu, został opublikowany w Science Advances. Izotermiczna amplifikacja DNA i odczyt CRISPR są połączone w jednej probówce; dwa konserwatywne insercje M. tuberculosis (IS6110 i IS1081) są testowane jednocześnie, plus ludzki gen jako wewnętrzna kontrola próbki. W małym „ślepym” teście na próbkach klinicznych test dał 100% czułości (6/6) i 100% swoistości (7/7) w porównaniu z hodowlą; granica wykrywalności wynosi ~69–81 CFU/ml w symulowanej plwocinie. Wynik można zobaczyć na papierowym pasku testowym, a odczynniki są liofilizowane (przechowywanie bez „łańcucha chłodniczego”).

Tło

Według WHO, gruźlica zabije około 1,25 miliona osób w 2023 roku; gruźlica ponownie stała się główną zakaźną przyczyną zgonów, z szacunkową liczbą 10,8 miliona przypadków. To sprawia, że dostępna i szybka diagnostyka ma kluczowe znaczenie, szczególnie w warunkach ograniczonego dostępu do zasobów.

• Obecne testy to kompromis między dokładnością, szybkością i ceną. „Złoty standard” – hodowla jest bardzo dokładna, ale powolna; mikroskopia jest szybka, ale mało czuła; platformy PCR, takie jak Xpert MTB/RIF Ultra, są znacznie bardziej czułe (LOD ≈ 15,6 CFU/ml), ale wymagają drogiego sprzętu i kaset, co ogranicza zasięg.
• Dlaczego izotermiczna i CRISPR? Izotermiczna amplifikacja RPA działa w temperaturach 37–42°C i nie wymaga termocyklerów – co jest wygodne „w terenie”. Odczyt CRISPR (Cas12/13) zwiększa specyficzność gatunkową i umożliwia wizualny przepływ boczny („pasek”) bez skomplikowanej optyki. W sumie, to droga do przenośnych i tanich testów PVR.
• Dlaczego dwa cele MBT jednocześnie (IS6110 + IS1081)? IS6110 to wielokopijowa wstawka kompleksu M. tuberculosis, ale niektóre linie mają niewiele kopii, a testy na obecność samego IS6110 mogą „nie dać rezultatu”. Dodanie drugiej wstawki IS1081 zmniejsza ryzyko fałszywie ujemnych wyników.
• Dlaczego wewnętrzna kontrola człowieka? Próbki oddechu mogą zawierać inhibitory i „złe” próbki. Endogenna kontrola człowieka (np. RNaza P/genomowe DNA) potwierdza, że materiał jest odpowiedni i reakcja nie jest tłumiona – w przeciwnym razie wynik nie może być uznany za negatywny.
• Format jednogarnkowy jest sam w sobie ważny. Zmniejsza liczbę etapów, zmniejsza ryzyko skażenia i ułatwia pracę poza laboratorium. Takie podejście do badań nad gruźlicą już się sprawdziło; nowe badania rozszerzają tę ideę na format dwucelowy z kontrolą wewnętrzną, a także demonstrują liofilizację odczynników i czytnik pasków.
• Jaka jest wartość niniejszego artykułu? Autorzy zademonstrowali wykrywalność bezpośrednio z plwociny po uproszczonym przygotowaniu próbki, granicę wykrywalności na poziomie ~70–80 CFU/ml w symulowanej plwocinie oraz 100% czułość/swoistość w małym, ślepym zestawie próbek klinicznych – dobry „pokaz techniczny” do dalszych wieloośrodkowych walidacji.

Jak to działa

• Naukowcy połączyli RPA (szybką izotermiczną amplifikację materiału genetycznego w temperaturze 37°C) z enzymami „tnącymi” Cas13a/Cas12a. Po wybraniu przewodnich RNA, skonfigurowali system tak, aby celował w dwa cele MBT jednocześnie i równolegle do ludzkiego DNA (sprawdzając, czy w próbce w ogóle znajduje się materiał i czy reakcja nie „zatrzymała się”).
• Cała odczyn chemiczny umieszczany jest w jednej probówce; po inkubacji wynik odczytuje się za pomocą fluorymetru lub paska testowego bocznego przepływu - zasadniczo jak w teście ekspresowym.
• Przetwarzanie plwociny zostało uproszczone do podgrzewania i krótkiego wirowania – bez ekstraktorów kwasów nukleinowych. W przypadku najbardziej ograniczonych możliwości, autorzy omawiają nawet ręczne alternatywy dla wirówki.

Co wykazały testy

• Granica wykrywalności: 69,0 CFU/ml (szczep H37Rv) i 80,5 CFU/ml (BCG) w plwocinie kolczastej. Nie stwierdzono reaktywności krzyżowej z innymi bakteriami/grzybami.
• Warunki kliniczne (próby zaślepione): na 13 próbkach z praktyki klinicznej – 100% czułości (6/6) i 100% swoistości (7/7) w stosunku do zaszczepienia. Dla porównania, na tym samym zestawie GeneXpert Ultra wykazał odpowiednio 100%/86%.
• Niuanse techniczne: z dwóch opcji odczytu, Cas13a sprawdził się lepiej (w formacie „one-pot” jest bardziej czuły niż Cas12a). Ponadto równoległe testowanie dwóch celów Mtb zmniejsza ryzyko uzyskania fałszywych wyników.

Dlaczego jest to konieczne?

Dzisiejsze testy to kompromis między dokładnością, szybkością i dostępnością: hodowla jest bardzo dokładna, ale powolna; wymazy są szybkie, ale niedokładne; systemy PCR, takie jak GeneXpert, są dokładne i szybkie, ale wymagają drogich urządzeń i kaset. Nowe podejście CRISPR ma na celu zniwelowanie tej różnicy: diagnostyka terenowa, która działa w temperaturze 37°C, z odczytami na paskach papieru i możliwością przechowywania odczynników bez chłodzenia.

Ograniczenia i co dalej

To wczesna demonstracja na małym zestawie klinicznym – potrzebne są duże, wieloośrodkowe testy (w tym koinfekcja HIV u dzieci, z formami paucibacillarycznymi i różnymi liniami MBT). Autorzy osobno zauważają, że w wersji „terenowej” wirówka stołowa będzie musiała zostać zastąpiona w pełni manualnym rozwiązaniem. Jednak sama architektura – „dwa cele + kontrola wewnętrzna” w jednej probówce – już udowodniła swoją funkcjonalność i stanowi jasną ścieżkę do udoskonalenia w celu masowego zastosowania.

Źródło: Alexandra G. Bell i in. Uproszczony test oparty na CRISPR do wykrywania gruźlicy bezpośrednio z plwociny, Science Advances, online 6 sierpnia 2025 r. (tom 11, wydanie 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206